RT-PCR Kit（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）

產(chǎn)品說明

RT-PCR Kit(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）是專為兩步法RT-PCR第一步實(shí)驗(yàn)配制的、具有高靈敏度的RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)合理配備了與cDNA第一鏈合成反應(yīng)相關(guān)的各種組分，優(yōu)化的體系保證了M-MLV具有高效的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，所得cDNA對后續(xù)的PCR或定量PCR實(shí)驗(yàn)兼容性好，可用于檢測稀有基因的表達(dá)、從極少數(shù)細(xì)胞中定量檢測特定mRNA的表達(dá)水平、克隆特定基因的cDNA片段等。

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是由一個(gè)71 kD的單亞基組成的重組型DNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶。可以催化以RNA或DNA：RNA雜交鏈為模板的互補(bǔ)DNA 的聚合反應(yīng)。本酶經(jīng)修飾RNase H活性比普通的逆轉(zhuǎn)錄酶要弱很多，因此在合成第一鏈cDNA的過程中，可保證RNA的降解程度較低，從而使得率提高。

產(chǎn)品組分

R1011可進(jìn)行20次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),R1012可進(jìn)行100次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（20 μl 標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系，每次使用 M-MLV 1μl）。

M-MLV 儲(chǔ)存液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

200 mM NaCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01% NP-40

50% glycerol

5xfirst-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

375 mM KCl

15 mM MgCl2

50 mM DTT

質(zhì)量檢測

逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測

使用[32P]dCTP作為標(biāo)記，200 U的 M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA為模板進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最低可得到120ng的cDNA，所得cDNA長度 > 全長的90%。

核酸外切酶活性檢測

混合50ng的標(biāo)記DNA 或RNA與200U M-MLV在1×反應(yīng)緩沖液體系中，37℃溫浴1 h，檢測DNA和RNA降解都不到總量的1%。

適用范圍

第一鏈cDNA 合成

cDNA文庫構(gòu)建

RT-PCR

引物延伸

3'和5' RACE

注意事項(xiàng)

l  成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長的完整性并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或 SDS。用于cDNA合成反應(yīng)的溶液試劑盡可能用DEPC進(jìn)行處理，并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能用高壓滅菌處理時(shí)，首先用經(jīng)過滅菌的器具、水等配制溶液后，再將溶液進(jìn)行過濾除菌處理。

l  為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2 M同時(shí)加入4倍體積的乙醇，室溫放置3-5 min，10,000 rpm離心5 min。

l  在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑（RNasin）以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。在第一鏈合成反應(yīng)中，RNase抑制劑在緩沖液和還原劑（如 DTT）存在的條件下加入，因?yàn)?/span>cDNA合成前的過程會(huì)使抑制劑變性，從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C 對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了RNase抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

l  較高的保溫溫度有助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開，增加反應(yīng)的產(chǎn)量。

l  使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足RT-PCR反應(yīng)的RNA，但為了保證實(shí)驗(yàn)的成功率，建議使用GTC法（異硫氰酸胍法）制備的高純度RNA。

l  為防止RNA降解，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，最好保存于-70℃。

l  最佳的PCR反應(yīng)條件，因PCR擴(kuò)增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前最好先試做一下control反應(yīng)，以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。

l  cDNA產(chǎn)物應(yīng)置于-20℃保存。

l  當(dāng)以cDNA為模板進(jìn)行PCR之前，使用RNase H處理cDNA，可以提高PCR反應(yīng)的靈敏度。

操作步驟

1 在冰浴的無菌離心管中配制下列混合物

1-5μg RNA

1μl Oligo(dT)₁₅ 或Random primer，

補(bǔ)RNase-free ddH₂O至13.4μl；

2進(jìn)行變性退火反應(yīng)

70℃溫浴5 min,

簡短離心后冰浴5 min；

3在上述離心管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液

4 μl  5×first-strand buffer

1 μl  dNTPs（10 mM each）

0.6μl  RNasin ,

1 μl   M-MLV；

4按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

Oligo (dT)₁₅ ：42℃溫浴60 min；

Random primer： 37℃溫浴60 min。

5終止反應(yīng)

70℃溫浴5 min終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。

6用RNase-free ddH₂O將反應(yīng)體系稀釋到50μl，取2-5μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。