RT-PCR Kit(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)
產(chǎn)品說明
RT-PCR Kit(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)是專為兩步法RT-PCR第一步實(shí)驗(yàn)配制的、具有高靈敏度的RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)合理配備了與cDNA第一鏈合成反應(yīng)相關(guān)的各種組分,優(yōu)化的體系保證了M-MLV具有高效的逆轉(zhuǎn)錄酶活性,所得cDNA對后續(xù)的PCR或定量PCR實(shí)驗(yàn)兼容性好,可用于檢測稀有基因的表達(dá)、從極少數(shù)細(xì)胞中定量檢測特定mRNA的表達(dá)水平、克隆特定基因的cDNA片段等。
M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是由一個(gè)71 kD的單亞基組成的重組型DNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶。可以催化以RNA或DNA:RNA雜交鏈為模板的互補(bǔ)DNA 的聚合反應(yīng)。本酶經(jīng)修飾RNase H活性比普通的逆轉(zhuǎn)錄酶要弱很多,因此在合成第一鏈cDNA的過程中,可保證RNA的降解程度較低,從而使得率提高。
產(chǎn)品組分
貨號(hào) | R1011(20次) | R1012(100次) |
M-MLV(200U/μl) | 20 μl | 100 μl |
RNasin(40U/μl) | 12 μl | 60 μl |
Oligo d(T)15 Primer(50 μM) | 20 μl | 100 μl |
Random primer(50 μM) | 20 μl | 100 μl |
5xfirst-strand buffer | 80 μl | 400 μl |
RNase-free ddH2O | 1 ml | 1 ml×5 |
dNTPs(10mM each) | 50 μl | 250 μl |
R1011可進(jìn)行20次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),R1012可進(jìn)行100次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(20 μl 標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系,每次使用 M-MLV 1μl)。
M-MLV 儲(chǔ)存液
20 mM Tris-HCl (pH 7.5)
200 mM NaCl
0.1 mM EDTA
1 mM DTT
0.01% NP-40
50% glycerol
5xfirst-strand buffer 成分
250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)
375 mM KCl
15 mM MgCl2
50 mM DTT
質(zhì)量檢測
逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測
使用[32P]dCTP作為標(biāo)記,200 U的 M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA為模板進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),最低可得到120ng的cDNA,所得cDNA長度 > 全長的90%。
核酸外切酶活性檢測
混合50ng的標(biāo)記DNA 或RNA與200U M-MLV在1×反應(yīng)緩沖液體系中,37℃溫浴1 h,檢測DNA和RNA降解都不到總量的1%。
適用范圍
第一鏈cDNA 合成
cDNA文庫構(gòu)建
RT-PCR
引物延伸
3'和5' RACE
注意事項(xiàng)
l 成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長的完整性并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑,如EDTA或 SDS。用于cDNA合成反應(yīng)的溶液試劑盡可能用DEPC進(jìn)行處理,并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能用高壓滅菌處理時(shí),首先用經(jīng)過滅菌的器具、水等配制溶液后,再將溶液進(jìn)行過濾除菌處理。
l 為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性,可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí),可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl至0.2 M同時(shí)加入4倍體積的乙醇,室溫放置3-5 min,10,000 rpm離心5 min。
l 在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑(RNasin)以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。在第一鏈合成反應(yīng)中,RNase抑制劑在緩沖液和還原劑(如 DTT)存在的條件下加入,因?yàn)?/span>cDNA合成前的過程會(huì)使抑制劑變性,從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防止RNase A,B,C 對RNA的降解,并不能防止皮膚上的RNase,因此盡管使用了RNase抑制劑,也要小心不要從手指上引入RNase。
l 較高的保溫溫度有助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開,增加反應(yīng)的產(chǎn)量。
l 使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足RT-PCR反應(yīng)的RNA,但為了保證實(shí)驗(yàn)的成功率,建議使用GTC法(異硫氰酸胍法)制備的高純度RNA。
l 為防止RNA降解,應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融,最好保存于-70℃。
l 最佳的PCR反應(yīng)條件,因PCR擴(kuò)增儀的不同而不同,所以在使用您的樣品之前最好先試做一下control反應(yīng),以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。
l cDNA產(chǎn)物應(yīng)置于-20℃保存。
l 當(dāng)以cDNA為模板進(jìn)行PCR之前,使用RNase H處理cDNA,可以提高PCR反應(yīng)的靈敏度。
操作步驟
1 在冰浴的無菌離心管中配制下列混合物
1-5μg RNA
1μl Oligo(dT)15 或Random primer,
補(bǔ)RNase-free ddH2O至13.4μl;
2進(jìn)行變性退火反應(yīng)
70℃溫浴5 min,
簡短離心后冰浴5 min;
3在上述離心管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
4 μl 5×first-strand buffer
1 μl dNTPs(10 mM each)
0.6μl RNasin ,
1 μl M-MLV;
4按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
Oligo (dT)15 :42℃溫浴60 min;
Random primer: 37℃溫浴60 min。
5終止反應(yīng)
70℃溫浴5 min終止反應(yīng),置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。
6用RNase-free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋到50μl,取2-5μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。