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M-MLV(重組型逆轉(zhuǎn)錄酶)(R1041-R1042)

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M-MLV(重組型逆轉(zhuǎn)錄酶)(R1041-R1042)

價格: 200.00~360.00
運費 ¥0.00
R1041( 5000U) R1042(10000U)

M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶

產(chǎn)品說明

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是由一個 71 kD的單亞基組成的重組型DNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶。可以催化以RNADNARNA雜交鏈為模板的互補DNA 的聚合反應(yīng)。本酶經(jīng)修飾RNase H活性比普通的逆轉(zhuǎn)錄酶要弱很多,因此在合成第一鏈cDNA的過程中,可保證RNA的降解程度較低,從而使得率提高。

 

產(chǎn)品組分

組分

R1041

R1042

M-MLV (200U/μl)

5000U/25 μl

10000U/50 μl

 first-strand buffer

100 μl

200 μl

R1041可進(jìn)行25次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),R1042可進(jìn)行50次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(20 μl 標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)體系,每次使用 M-MLV 1 μl)。

M-MLV 儲存液成分

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)200 mM NaCl,0.1 mM EDTA1 mM DTT,0.01% NP-4050% glycerol

5x first-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃),375 mM KCl,15 mM MgCl2,50 mM DTT

 

保存條件

-20℃保存,避免反復(fù)凍融。

 

質(zhì)量檢測

逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測

使用[32P]dCTP作為標(biāo)記,200 UM-MLV1μg、1.2 kbRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),最低可得到120 ngcDNA,所得cDNA長度 > 全長的90%。

核酸外切酶活性檢測

混合50 ng的標(biāo)記DNARNA200 U M-MLV反應(yīng)緩沖液體系中,37℃溫浴1 h,檢測DNARNA降解都不到總量的1%。

核酸內(nèi)切酶活性檢測

混合1μgⅠ型超螺旋質(zhì)粒DNA500 U M-MLV反應(yīng)緩沖液體系中,37℃溫浴1 h,瓊脂糖電泳檢測,無明顯的剪切。

 

適用范圍

第一鏈cDNA 合成;cDNA 文庫構(gòu)建;RT-PCR;引物延伸;3'  5' RACE

 

注意事項

l  成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長的完整性并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑,如EDTA SDS。用于cDNA合成反應(yīng)的溶液試劑盡可能用DEPC進(jìn)行處理,并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能用高壓滅菌處理時,首先用經(jīng)過滅菌的器具、水等配制溶液后,再將溶液進(jìn)行過濾除菌處理。

l  為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性,可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl0.2 M同時加入4倍體積的乙醇,室溫放置3-5 min10,000 rpm離心5 min。

l  在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑(RNasin)以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。在第一鏈合成反應(yīng)中,RNase抑制劑在緩沖液和還原劑(如 DTT)存在的條件下加入,因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性,從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防止RNase A,BRNA的降解,并不能防止皮膚上的RNase,因此盡管使用了RNase抑制劑,也要小心不要從手指上引入RNase。

l  較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開,增加反應(yīng)的產(chǎn)量。

l  使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足RT-PCR反應(yīng)的RNA,但為了保證實驗的成功率,建議使用GTC法(異硫氰酸胍法)制備的高純度RNA。

l  為防止RNA降解,應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融,最好保存于-70℃。

l  最佳的PCR反應(yīng)條件,因PCR擴增儀的不同而不同,所以在使用您的樣品之前最好先試做一下control反應(yīng),以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。

l  cDNA產(chǎn)物應(yīng)置于-20℃保存。

l  當(dāng)以cDNA為模板進(jìn)行PCR之前,使用RNase H處理cDNA,可以提高PCR反應(yīng)的靈敏度。

 

操作步驟

在冰浴的無菌離心管中配制下列混合物

 RNA

1-5 μg

Oligo (dT)15 Random primer

1 μl

RNase-free ddH2O

To 13.4 μl


進(jìn)行變性退火反應(yīng)

70℃溫浴5 min,簡短離心后冰浴5 min。

在上述離心管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液

 上述反應(yīng)液

13.4 μl

5× first-strand buffer

4 μl

dNTPs10 mM

1 μl

RNasin

0.6 μl

M-MLV

1 μl

Total

20 μl


按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

Oligo (dT)15 42℃溫浴60 min

Random primer 37℃溫浴60 min。

終止反應(yīng)

70℃溫浴5 min終止反應(yīng),置冰上進(jìn)行后續(xù)實驗或-20℃保存。

RNase-free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋到50μl,取2-5μl進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。


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