M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶
產(chǎn)品說明
M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是由一個 71 kD的單亞基組成的重組型DNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶。可以催化以RNA或DNA:RNA雜交鏈為模板的互補DNA 的聚合反應(yīng)。本酶經(jīng)修飾RNase H活性比普通的逆轉(zhuǎn)錄酶要弱很多,因此在合成第一鏈cDNA的過程中,可保證RNA的降解程度較低,從而使得率提高。
產(chǎn)品組分
組分 | R1041 | R1042 |
M-MLV (200U/μl) | 5000U/25 μl | 10000U/50 μl |
5× first-strand buffer | 100 μl | 200 μl |
R1041可進(jìn)行25次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),R1042可進(jìn)行50次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(20 μl 標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)體系,每次使用 M-MLV 1 μl)。
M-MLV 儲存液成分
20 mM Tris-HCl (pH 7.5),200 mM NaCl,0.1 mM EDTA,1 mM DTT,0.01% NP-40,50% glycerol
5x first-strand buffer 成分
250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃),375 mM KCl,15 mM MgCl2,50 mM DTT
保存條件
-20℃保存,避免反復(fù)凍融。
質(zhì)量檢測
逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測
使用[32P]dCTP作為標(biāo)記,200 U的M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),最低可得到120 ng的cDNA,所得cDNA長度 > 全長的90%。
核酸外切酶活性檢測
混合50 ng的標(biāo)記DNA或RNA與200 U M-MLV在1×反應(yīng)緩沖液體系中,37℃溫浴1 h,檢測DNA和RNA降解都不到總量的1%。
核酸內(nèi)切酶活性檢測
混合1μgⅠ型超螺旋質(zhì)粒DNA與500 U M-MLV在1×反應(yīng)緩沖液體系中,37℃溫浴1 h,瓊脂糖電泳檢測,無明顯的剪切。
適用范圍
第一鏈cDNA 合成;cDNA 文庫構(gòu)建;RT-PCR;引物延伸;3' 和 5' RACE。
注意事項
l 成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長的完整性并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑,如EDTA或 SDS。用于cDNA合成反應(yīng)的溶液試劑盡可能用DEPC進(jìn)行處理,并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能用高壓滅菌處理時,首先用經(jīng)過滅菌的器具、水等配制溶液后,再將溶液進(jìn)行過濾除菌處理。
l 為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性,可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl至0.2 M同時加入4倍體積的乙醇,室溫放置3-5 min,10,000 rpm離心5 min。
l 在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑(RNasin)以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。在第一鏈合成反應(yīng)中,RNase抑制劑在緩沖液和還原劑(如 DTT)存在的條件下加入,因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性,從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防止RNase A,B,C 對RNA的降解,并不能防止皮膚上的RNase,因此盡管使用了RNase抑制劑,也要小心不要從手指上引入RNase。
l 較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開,增加反應(yīng)的產(chǎn)量。
l 使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足RT-PCR反應(yīng)的RNA,但為了保證實驗的成功率,建議使用GTC法(異硫氰酸胍法)制備的高純度RNA。
l 為防止RNA降解,應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融,最好保存于-70℃。
l 最佳的PCR反應(yīng)條件,因PCR擴增儀的不同而不同,所以在使用您的樣品之前最好先試做一下control反應(yīng),以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。
l cDNA產(chǎn)物應(yīng)置于-20℃保存。
l 當(dāng)以cDNA為模板進(jìn)行PCR之前,使用RNase H處理cDNA,可以提高PCR反應(yīng)的靈敏度。
操作步驟
1 在冰浴的無菌離心管中配制下列混合物
RNA | 1-5 μg |
Oligo (dT)15 或Random primer | 1 μl |
RNase-free ddH2O | To 13.4 μl |
2 進(jìn)行變性退火反應(yīng)
70℃溫浴5 min,簡短離心后冰浴5 min。
3 在上述離心管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
上述反應(yīng)液 | 13.4 μl |
5× first-strand buffer | 4 μl |
dNTPs(10 mM) | 1 μl |
RNasin | 0.6 μl |
M-MLV | 1 μl |
Total | 20 μl |
4 按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
Oligo (dT)15 :42℃溫浴60 min;
Random primer: 37℃溫浴60 min。
5 終止反應(yīng)
70℃溫浴5 min終止反應(yīng),置冰上進(jìn)行后續(xù)實驗或-20℃保存。
6 用RNase-free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋到50μl,取2-5μl進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。