TRAzol

產(chǎn)品說明

TRAzol可以從動物組織、植物材料、各種微生物以及培養(yǎng)細(xì)胞等組織材料中提取總RNA。樣品在TRAzol中能夠充分被裂解，在加入氯仿離心后，溶液會形成上清層、中間層和有機(jī)層（下層），RNA分布在上清層中，收集上清層后，經(jīng)異丙醇沉淀便可以回收得到總RNA。經(jīng)本制品提取的總RNA純度高，基本不含蛋白質(zhì)及基因組DNA，提取的RNA可以直接用于Northern雜交、斑點(diǎn)雜交、mRNA純化、體外翻譯、RNA分解酶的保護(hù)分析、RT-PCR、構(gòu)建cDNA文庫等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品組分

需要自備氯仿、異丙醇、RNase-free 75%乙醇、DEPC處理水（R2041/R2042）

保存條件

室溫運(yùn)輸，2-8℃避光保存。

注意事項(xiàng)

●   TRAzol具有腐蝕性，操作過程中應(yīng)做好防護(hù)，避免直接接觸皮膚或吸入口鼻。沾染后應(yīng)立即用大量清水沖洗，必要時(shí)請就醫(yī)處理。

●   嚴(yán)防操作環(huán)境、使用的容器、耗材和試劑的RNase污染。操作過程中勤換手套。

●   根據(jù)起始材料量的不同使用不同體積的溶液（見下表）。過多或過少的使用量都可能影響RNA的質(zhì)量或產(chǎn)量。若起始材料量很少，RNA預(yù)計(jì)產(chǎn)量很低，在異丙醇沉淀時(shí)，可加入20 mg/ml肝糖原溶液0.5-1 μl促進(jìn)RNA沉淀。

●   不同起始材料試劑用量及TRAzol用量。

●   使用本產(chǎn)品提取的RNA一般不含有DNA污染。在極少數(shù)情況下（與組織pH值等相關(guān)），如果有DNA污染而又必須去除，則可以用RNase-free的DNase處理樣品。

●   防止DNA污染方法：a. 減少樣本起始用量，如將100 mg的植物組織減少為50 mg，將30 mg的動物組織減少為10 mg；

                      b. 在加入TRAzol之后加入5-10 ul 3M NaAc(pH5.2)。

●   請嚴(yán)格遵照操作步驟操作。

●   有關(guān)RNA的吸光度說明如下：

260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)等有機(jī)物的吸光度值。OD₂₆₀/OD₂₈₀（R）體現(xiàn)了RNA中的蛋白質(zhì)等有機(jī)物的污染程度，質(zhì)量較好的RNA的R值應(yīng)在1.8-2.0之間，當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中的蛋白質(zhì)等有機(jī)物的污染比較明顯；當(dāng)R>2.2時(shí)，說明RNA已經(jīng)被水解成了單核苷酸。在對核酸進(jìn)行吸光度檢測時(shí)，需要注意稀釋液應(yīng)使用TE Buffer。

●   RNA濃度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μl

操作步驟

1.      實(shí)驗(yàn)樣品的研磨和勻漿

A. 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

倒出培養(yǎng)液，用1X PBS清洗一次，每10 cm²生長的培養(yǎng)細(xì)胞中加入1ml的TRAzol，水平放置片刻，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面并裂解細(xì)胞，然后使用移液槍吹打細(xì)胞使其脫落（對于貼壁牢固的培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞刮勺剝離細(xì)胞）。將內(nèi)含細(xì)胞的裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。室溫靜置5 min。

B. 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

將懸浮培養(yǎng)細(xì)胞連同培養(yǎng)液一起倒入離心管中，8,000 rpm，4℃離心2 min，棄上清，向每10⁷個(gè)細(xì)胞中加入l-2 ml的TRAzol。用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，室溫靜置5 min。

C. 動物組織、植物材料樣品

將超低溫凍結(jié)的RNA提取樣品稱量后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的可見顆粒，如果沒有研磨徹底會影響RNA的收率和質(zhì)量）。對于普通的RNA提取樣品，可以向研缽中加入適量的TRAzol，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。對于特殊樣品，如肝、脾、骨及軟骨等，可以將研磨成粉末狀的樣品加入到含有適量的TRAzol的勻漿管中，把勻漿管置于冰浴中進(jìn)行勻漿，直至勻漿液呈無顆粒透明狀。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5 min。12,000 rpm 4 ℃離心5 min，小心吸取上清液，移入新的離心管中（切勿吸取沉淀）。

2.      Total RNA的提取

1  向上述步驟中的勻漿裂解液中加入氯仿（TRAzol的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，用力振蕩（氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管蓋突然彈開）。待充分乳化溶液呈乳白狀（無分相現(xiàn)象）后，再室溫靜置2 min。

2  12,000 rpm 4 ℃離心10 min。

3  從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即：無色的上清液、中間的白色層及帶有顏色的下層有機(jī)相，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）。

（如樣品含有較多多糖多酚，請?jiān)黾右韵虏襟E：在上清液中加入0.2X上清液體積的5 M NaCl及1X上清液體積的酚/氯仿（1:1），混勻，12000 rpm離心5-10 min ，取上清液加入等體積氯仿，混勻，12000 rpm 離心 5-10 min，至第4步。）

4  向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15-30℃下靜置10 min。

5  12,000 rpm 4℃離心10 min。一般在離心后，試管底部會出現(xiàn)沉淀。

3.      RNA沉淀的清洗

小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75％的乙醇1 ml（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000 rpm，4 ℃離心2 min后小心棄去乙醇（為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇），重復(fù)洗滌一次。

4.      RNA的溶解

室溫干燥沉淀2-5 min（不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會很難溶解），加入適量的RNase-free水溶解沉淀，必要時(shí)可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。