Pfu Mix

Cat. #：P2021，P2022

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

Pfu Mix是2×濃縮的PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液，含有Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、緩沖液等PCR擴(kuò)增必需組分（模板與引物除外）。使用時(shí)，僅需在擴(kuò)增體系中加入模板和引物即可進(jìn)行PCR，大大簡(jiǎn)化操作過程，縮短操作時(shí)間，降低污染（加樣次數(shù)減少）。同時(shí)，由于體系內(nèi)含有優(yōu)化劑與增強(qiáng)劑，能夠顯著增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的靈敏度。擴(kuò)增產(chǎn)物具有平末端。

Pfu DNA聚合酶是極端嗜熱性細(xì)菌Pyrococcus furiosus來源的高度熱穩(wěn)定DNA聚合酶，分子量為90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度可達(dá)5 kb（簡(jiǎn)單模板）。延伸速度為2min/kb（70-75℃，簡(jiǎn)單模板可達(dá)20s/kb）。該酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。

產(chǎn)品組成

本產(chǎn)品分含體系中包含溴酚藍(lán)、不含溴酚藍(lán)兩類。體系中包含溴酚藍(lán)的產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可直接電泳檢測(cè)。這兩類產(chǎn)品的擴(kuò)增性能無差異。如無特別說明提供體系中包含溴酚藍(lán)的包裝。

保存條件

-20℃保存2年。

質(zhì)量控制

純度檢測(cè)：經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測(cè)：PCR方法檢測(cè)無宿主殘余DNA，能有效擴(kuò)增人基因組中的單拷貝基因。

應(yīng)用舉例

1. 配制反應(yīng)體系

請(qǐng)于冰上配置反應(yīng)體系，體系大小與組分用量與添加順序可調(diào)整：

[1] 引物終濃度建議范圍：0.1-1 μM。特異性差時(shí)可降低濃度，效率低時(shí)可提高濃度。

[2] 不同模板最佳用量不同，部分DNA模板建議用量如下表（50 μl反應(yīng)體系）。

[3] 可單獨(dú)訂購(gòu)超純水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。

[4] 可單獨(dú)訂購(gòu)25mM MgCl₂（Cat. #：P9031）和PCR Enhancer（Cat. #：P9041）。

2. 設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)

[1] 退火溫度應(yīng)根據(jù)Tm值較低的引物來設(shè)。

[2] 延伸時(shí)間按2min/kb來設(shè)最佳（簡(jiǎn)單模板可達(dá)20s/kb）。

3. 分析結(jié)果

反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設(shè)備觀察目的條帶的擴(kuò)增情況。如有需要，可進(jìn)行割膠回收。

無產(chǎn)物或產(chǎn)物量少的改進(jìn)措施有：1調(diào)整退火溫度；2減少抑制劑的影響，如提取的基因組DNA中含有抑制擴(kuò)增的成分，需要高倍稀釋（1: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模板DNA的純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl₂（Cat. #：P9031）等可提高產(chǎn)量。

操作注意事項(xiàng)

1 室溫下Pfu DNA聚合酶有一定的活性，為避免發(fā)生非特異性擴(kuò)增，請(qǐng)于冰上配置反應(yīng)體系，并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。

2 Pfu DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物只有平末端，可直接用于平末端連接。如要進(jìn)行TA克隆，請(qǐng)先進(jìn)行加A反應(yīng)，以提高克隆效率。（加A反應(yīng)：參考如下體系，72℃，15-30min）

3 堿基出錯(cuò)率是指在每個(gè)堿基合成過程中所摻入的錯(cuò)誤核苷酸數(shù)目。Pfu DNA聚合酶的堿基錯(cuò)誤率為1×10^-6。

4 dUTP、dITP和含有這些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR擴(kuò)增。因?yàn)樵撁概c含有尿嘧啶和次黃嘌呤的DNA模板結(jié)合后會(huì)中止DNA聚合反應(yīng)。

引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

引物長(zhǎng)度一般在15-30個(gè)堿基之間；上下游引物3’末端避免互補(bǔ)，避免出現(xiàn)3個(gè)以上重復(fù)的G或C，或出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量盡量接近；Tm值控制在55-65℃之間，且上下游引物Tm值盡量接近，額外附加序列（酶切位點(diǎn)、修飾等）是非模板匹配序列，不參與Tm值計(jì)算。

相關(guān)產(chǎn)品

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問：PfuMix的反應(yīng)體系與普通Pfu DNA聚合酶的反應(yīng)體系有何不同？

答：PfuMix的反應(yīng)體系中除Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、Mg2+等常規(guī)組分外，還包含適當(dāng)比例的PCR Enhancer與穩(wěn)定劑。而且，反應(yīng)體系中的離子種類

與濃度也有所區(qū)別。

問：為什么PfuMix的靈敏度與擴(kuò)增效率會(huì)高于普通Pfu DNA聚合酶？

答：這是由于東盛對(duì)PfuMix反應(yīng)緩沖液中的成分與濃度進(jìn)行了優(yōu)化。我們?cè)赑fuMix反應(yīng)緩沖液中添加了適當(dāng)比例的PCR Enhancer，提高了聚合酶的熱穩(wěn)定性，

顯著降低DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于PCR擴(kuò)增的影響。同時(shí)，對(duì)PfuMix反應(yīng)緩沖液中的離子濃度與比例進(jìn)行優(yōu)化，使得聚合酶處于最適活性狀態(tài)，從而獲得了最佳的

擴(kuò)增效率。

問：PfuMix的保真性與擴(kuò)增片段長(zhǎng)度是多少？

答：PfuMix的保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍。對(duì)于簡(jiǎn)單模板，PfuMix可擴(kuò)增2 kb以下的片段。

問：PfuMix的擴(kuò)增產(chǎn)物能否直接進(jìn)行TA克?。?/p>

答：不可以直接進(jìn)行TA克隆。建議對(duì)PCR產(chǎn)物純化后，加A再進(jìn)行TA克隆。