Long Taq Mix

Cat. #：P2061，P2062

產(chǎn)品簡介

Long Taq Mix是2×濃縮的PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液，含有Long Taq DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等PCR擴(kuò)增必需組分（模板與引物除外）。使用時(shí)，僅需在擴(kuò)增體系中加入模板和引物即可進(jìn)行PCR，大大簡化操作過程，縮短操作時(shí)間，降低污染（加樣次數(shù)減少）。同時(shí)，由于體系內(nèi)含有優(yōu)化劑與增強(qiáng)劑，能夠顯著增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的靈敏度。

Long Taq DNA聚合酶是專門用于擴(kuò)增長片段的嗜熱DNA聚合酶，其保真性是普通Taq DNA聚合酶的3倍左右。擴(kuò)增片段的長度可達(dá)20 kb（簡單模板）。在擴(kuò)增復(fù)雜模板（如GC-rich或重復(fù)序列）時(shí)，Long Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增效率顯著高于Taq DNA聚合酶。因此Long Taq DNA聚合酶適合＞5kb的DNA片段及復(fù)雜模板的擴(kuò)增。延伸速度為20s/kb（70~75℃，簡單模板可達(dá)5s/kb）。擴(kuò)增產(chǎn)物具有兩種末端：平末端與3'-dA。

產(chǎn)品組成

本產(chǎn)品分含體系中包含溴酚藍(lán)、不含溴酚藍(lán)兩類。體系中包含溴酚藍(lán)的產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可直接電泳檢測。這兩類產(chǎn)品的擴(kuò)增性能無差異。如無特別說明提供體系中包含溴酚藍(lán)的包裝。

[1] PCR Enhancer主要通過降低DNA模板的解鏈溫度，促進(jìn)DNA模板的有效擴(kuò)增，增加PCR反應(yīng)的靈敏度和特異性?？蓡为?dú)訂購（Cat. #：P9041）。

保存條件

-20℃保存2年。

質(zhì)量控制

純度檢測：經(jīng)質(zhì)量檢測，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測：PCR方法檢測無宿主殘余DNA，能有效擴(kuò)增人基因組中的單拷貝基因。

應(yīng)用舉例

1. 配制反應(yīng)體系

請(qǐng)于冰上配置反應(yīng)體系，體系大小與組分用量與添加順序可調(diào)整：

[1] 引物終濃度建議范圍：0.1-1 μM。特異性差時(shí)可降低濃度，效率低時(shí)可提高濃度。

[2] 不同模板最佳用量不同，部分DNA模板建議用量如下表（50 μl反應(yīng)體系）。

[3] 可單獨(dú)訂購超純水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。

[4] 可單獨(dú)訂購25mM MgCl₂（Cat. #：P9031）。

2. 設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)

[1] 退火溫度應(yīng)根據(jù)Tm值較低的引物來設(shè)。

[2] 延伸時(shí)間按20s/kb來設(shè)最佳（簡單模板可達(dá)5s/kb）。

3. 分析結(jié)果

反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設(shè)備觀察目的條帶的擴(kuò)增情況。如有需要，可進(jìn)行割膠回收。

無產(chǎn)物或產(chǎn)物量少的改進(jìn)措施有：1調(diào)整退火溫度；2減少抑制劑的影響，如提取的基因組DNA中含有抑制擴(kuò)增的成分，需要高倍稀釋（1:；10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模板DNA的純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl₂（Cat. #：P9031）等可提高產(chǎn)量。

操作注意事項(xiàng)

1 室溫下Long Taq DNA聚合酶有一定的活性，為避免發(fā)生非特異性擴(kuò)增，請(qǐng)于冰上配置反應(yīng)體系，并且最后添加模板DNA。

2 Long Taq Mix的擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種末端：平末端和3'-dA突出末端。如要進(jìn)行TA克隆，請(qǐng)先進(jìn)行加A反應(yīng)，以提高克隆效率。（加A反應(yīng)：參考如下體系，72℃，15-30min）

3 Long Taq Mix既可擴(kuò)增長片段的DNA，也可擴(kuò)增小片段（幾百bp）的DNA。

4 PCR Enhancer主要在Long Taq Mix擴(kuò)增無結(jié)果或擴(kuò)增效果不好時(shí)使用。使用后退火溫度需在原溫度上降低2-3℃，否則會(huì)降低PCR效率，建議使用Tm值較高的引物。PCR Enhancer能夠與所有的耐熱DNA聚合酶共同作用。

引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

引物長度一般在15-30個(gè)堿基之間；上下游引物3’末端避免互補(bǔ)，避免出現(xiàn)3個(gè)以上重復(fù)的G或C，或出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量盡量接近；Tm值控制在55-65℃之間，且上下游引物Tm值盡量接近，額外附加序列（酶切位點(diǎn)、修飾等）是非模板匹配序列，不參與Tm值計(jì)算。

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