FS? Mix Direct for Tissue

Cat. #：P2071b，P2072b

產(chǎn)品簡介

FS? Mix Direct for Tissue是適合組織樣本擴(kuò)增的2×濃縮快速高效PCR預(yù)混合溶液，含有FS? Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、緩沖液等PCR擴(kuò)增必需組分（模板與引物除外）。使用時，僅需在擴(kuò)增體系中加入簡單處理后的樣本處理液和引物即可進(jìn)行PCR，從而可以極大地簡化操作過程，縮短操作時間，降低污染（加樣次數(shù)減少）。FS? Mix Direct for Tissue的反應(yīng)體系經(jīng)過優(yōu)化處理，高靈敏度的FS? Taq DNA聚合酶確保處理液中的微量樣本得到高效擴(kuò)增。本產(chǎn)品不用進(jìn)行繁瑣的DNA提取，最大限度減少實(shí)驗(yàn)誤差和交叉污染；同時依靠特殊的緩沖體系增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性，保證擴(kuò)增效果與DNA模板擴(kuò)增效果同樣可靠。

FS? Taq DNA聚合酶是根據(jù)蛋白工程原理，以Taq DNA聚合酶為基礎(chǔ)，研發(fā)設(shè)計的新一代DNA聚合酶。本產(chǎn)品具有類似KOD酶的快速擴(kuò)增能力，延伸速度為20s/kb（70~75℃，簡單模板可達(dá)5s/kb）。是普通Taq DNA聚合酶的3倍，可縮短一半以上的擴(kuò)增時間；同時具備Taq DNA聚合酶擴(kuò)增效率高、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)。FS? Taq DNA聚合酶使用方法與普通Taq DNA聚合酶基本相同，只需注意適當(dāng)縮短延伸時間。該酶具有5'→3'聚合酶活性，無3'→5'外切酶活性。擴(kuò)增產(chǎn)物具有3'-dA突出端，可直接用于TA克隆。

產(chǎn)品組成

本產(chǎn)品分體系中包含溴酚藍(lán)、不含溴酚藍(lán)兩類。體系中包含溴酚藍(lán)的產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可直接電泳檢測。這兩類產(chǎn)品的擴(kuò)增性能無差異。如無特別說明提供體系中包含溴酚藍(lán)的包裝。

保存條件

-20℃保存2年。

質(zhì)量控制

純度檢測：經(jīng)質(zhì)量檢測，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測：PCR方法檢測無宿主殘余DNA，能有效擴(kuò)增人基因組中的單拷貝基因。

應(yīng)用舉例

1. 處理樣品

組織：取3-5mg組織置于1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization Solution，充分渦旋振蕩，5,000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴(kuò)增。

頭發(fā)：取兩根帶毛囊的頭發(fā)，剪下帶毛囊的發(fā)根放入1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization Solution，充分渦旋振蕩，5000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴(kuò)增。

口腔拭子：取樣前30min內(nèi)請勿進(jìn)食及飲水，使用無菌棉簽在口腔內(nèi)擦拭10次。將棉球剪下置于1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction  Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization Solution，充分渦旋振蕩，5,000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴(kuò)增。

培養(yǎng)細(xì)胞：如果是懸浮培養(yǎng)細(xì)胞直接取1×10³-10⁴當(dāng)量的細(xì)胞加入到50 μl PCR反應(yīng)體系中即可。如果是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，取3-5mg細(xì)胞組織置于1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization Solution，充分渦旋振蕩，5,000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴(kuò)增。

血液、淋巴液DNA病毒：取100 μl血清或淋巴液至1.5ml離心管中，加入180 μl Extraction Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization  Solution，充分渦旋振蕩，12,000rpm離心10min，取0.5-2 μl上清進(jìn)行擴(kuò)增。

2. 配制反應(yīng)體系

請于冰上配置反應(yīng)體系，體系大小與組分用量與添加順序可調(diào)整：

[1] 引物終濃度建議范圍：0.1-1 μM。特異性差時可降低濃度，效率低時可提高濃度。

[2] 可單獨(dú)訂購超純水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。

[3] 可單獨(dú)訂購25mM MgCl₂（Cat. #：P9031）和PCR Enhancer（Cat. #：P9041）。

3. 設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)

大多數(shù)模板的快速擴(kuò)增條件：

[1] 退火溫度應(yīng)根據(jù)Tm值較低的引物來設(shè)。

[2] 延伸時間按20 sec/kb來設(shè)最佳。

1kb簡單模板的快速擴(kuò)增條件：

由于1kb簡單模板的二級結(jié)構(gòu)簡單，且長度較短，可同時縮短變性、退火時間至15s，延伸時間20s，以實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增。

4. 分析結(jié)果

反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設(shè)備觀察目的條帶的擴(kuò)增情況。如有需要，可進(jìn)行割膠回收。無產(chǎn)物或產(chǎn)物量少的改進(jìn)措施有：1調(diào)整退火溫度；2減少抑制劑的影響，如提取的基因組DNA中含有抑制擴(kuò)增的成分，需要高倍稀釋（1: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模板DNA的純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl₂（Cat. #：P9031）等可提高產(chǎn)量。

操作注意事項(xiàng)

處理的組織樣本往往不會完全溶解，這是正?，F(xiàn)象。溶解在處理液中的組織樣本足夠滿足FS? Mix Direct for Tissue擴(kuò)增的需要。

室溫下FS? Taq DNA聚合酶有一定的活性，為避免發(fā)生非特異性擴(kuò)增，請于冰上配置反應(yīng)體系，并且最后添加模板DNA。

延伸時間視片段長度而定。一般情況，≤500bp目的片段延伸15s，500bp-1kb延伸20s，＞1kb延伸時間按20s/kb計算。

FS? Taq DNA聚合酶具有脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，因此在PCR產(chǎn)物3’末端通常會加上一個多余的脫氧腺嘌呤核苷，可進(jìn)行TA克隆。

FS? Mix Direct for Tissue也可采用常規(guī)程序擴(kuò)增。

引物設(shè)計注意事項(xiàng)

引物長度一般在15-30個堿基之間；上下游引物3’末端避免互補(bǔ)，避免出現(xiàn)3個以上重復(fù)的G或C，或出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量盡量接近；Tm值控制在55-65℃之間，且上下游引物Tm值盡量接近，額外附加序列（酶切位點(diǎn)、修飾等）是非模板匹配序列，不參與Tm值計算。

相關(guān)產(chǎn)品

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問：使用FSTM Mix Direct for tissue擴(kuò)增時是否需要使用快速PCR擴(kuò)增儀？

答：不需要，使用普通的PCR擴(kuò)增儀即可。

問：FSTM MixDirect for  tissue的使用與普通Taq Mix 有何不同？

答：使用方法與普通PCR Mix 基本相同，只需注意擴(kuò)增條件中時間適當(dāng)縮短。

問：FSTM Mix Direct for  tissue擴(kuò)增產(chǎn)物是否可用于TA克隆？

答：FSTM Taq DNA 聚合酶 沒有3-5外切酶活性，所以PCR產(chǎn)物末端帶 A，可進(jìn)行TA克隆。

問：FSTM 系列與KOD系列產(chǎn)品相比有什么區(qū)別？

答：KOD有3-5外切酶活性，保真性比較高，但正因?yàn)橛型馇忻富钚?，容易降解引物及模板，所以其靈敏度及易用性方面不如FSTM Taq。普通檢測及基因診斷很少用到KOD

酶。