1、  在提核酸前，對實驗樣品你應(yīng)該知道什么？

樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。

絕大情況下，使用新鮮樣品可以獲得最好的結(jié)果，但對一些雜質(zhì)含量高的樣品，-20℃保存一天后抽提，可能會有更好的效果。樣品如果因為某些原因必須先行保存，也要先簡化一下樣品：血液最好只保存有核細(xì)胞；將樣品分割后保存，避免反復(fù)凍融；如果實驗室不具備合適的保存條件，可將樣品先裂解后再保存。

2、  怎樣選擇裂解方法？

⑴  含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組 DNA 的首選。某些樣品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也強(qiáng)烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)) ，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。

⑵  不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，仍然在細(xì)胞基因組 DNA 抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡撸?jīng)濟(jì)性及操作簡單很重要時。

① 高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首選。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的 RNA 酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA 的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。該方法也可用于基因組 DNA 抽提，非?？焖俸唵危兌炔皇呛芨?。
  ② 含 CTAB 的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細(xì)菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是 CTAB 的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因為即使是同一公司生產(chǎn)的純度一樣的 CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時， CTAB 的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時的溫度，多使用 65℃；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴(yán)重或者得率太低，可以試一下 37℃ – 45℃ 這個相對低溫的區(qū)域。
  ③ SDS 堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA 污染的特點(diǎn)。控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4℃會更好一些，所以，加入溶液 III 后在4℃靜置一段時間以及采用4℃離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結(jié)合 PC 純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100μg/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 μg/ml) 來實現(xiàn)?？偟母杏X是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對大質(zhì)粒 (50 kb 以上)，該方法可能會有問題。

3、  不同純化方法之間有什么不同？

⑴  PC 抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟(jì)、方便。PC 抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。PC 抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強(qiáng)烈到 DNA 變成 10kb 以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR 和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻──此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的，超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組 DNA 會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點(diǎn)，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點(diǎn)要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC 抽提的，否則核酸必定降解?？傊?，該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。
⑵  高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點(diǎn)。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4℃會更好一些。
⑶  介質(zhì)純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因為受人為操作因素影響小，純度的穩(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點(diǎn)是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因為加入的液體通過離心后會進(jìn)入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的，而目前核酸純化試劑盒也多為此方法。

4、 醇的沉淀

⑴  醇的沉淀，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 – 的分離。實際操作中，許多雜質(zhì)也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。如果核酸抽提的起始樣品是比較“臟”的，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。TRIzol 提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。
⑵  PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。雖然它們遠(yuǎn)沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點(diǎn)。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。

5、 怎樣去洗滌沉淀？

洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時 (使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因為他來自國外，自然就有了“水土不服”的問題。如果離心管是經(jīng)過硅化的，因為液體幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非?？捎^，其殘留量多到會影響后續(xù)的實驗。唯一不受管子質(zhì)量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強(qiáng)度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強(qiáng)，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點(diǎn)，洗滌次數(shù)也要考慮增加。最關(guān)鍵的，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。

6、 怎樣保存核酸？

純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認(rèn)為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風(fēng)險；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA?；旧希怂嵩诒４嬷械姆€(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。如果溫度合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導(dǎo)致的水解 (RNA 在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個不為人重視的，就是 EP 管對核酸的影響。首先一定要堅信一點(diǎn)，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到某種均衡。EP 管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時，則比較明顯了。如抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多，除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實驗所證明，但許多實驗人員并沒有將該建議當(dāng)回事。

7、 核酸質(zhì)量檢測

將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實驗，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍)，該方法還是非常可信的；電泳還可以用于估計核酸的濃度，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗有關(guān)。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準(zhǔn)確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進(jìn)行紫外和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實驗而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實驗，也不用大驚小怪。