Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 實(shí)驗(yàn)方案 1

多克隆瘧原蟲(chóng)株系中特定單倍型藥物反應(yīng)表型的剖析：

1. 實(shí)驗(yàn)材料和試劑準(zhǔn)備

- 選擇3個(gè)疑似多克隆的P. falciparum株系，例如：IPC_3445 (MRA-1236), IPC_5202 (MRA-1240), IPC_6403 (MRA-1285)。

- 準(zhǔn)備O+型人類(lèi)紅細(xì)胞和RPMI 1640培養(yǎng)基，以及所需的補(bǔ)充劑和抗生素。

- 準(zhǔn)備氯喹、甲氟喹和哌拉喹藥物儲(chǔ)備溶液。

- 準(zhǔn)備用于DNA提取、基因分型和PCR反應(yīng)的相關(guān)試劑。

2. 瘧原蟲(chóng)株系的體外培養(yǎng)

- 使用標(biāo)準(zhǔn)體外培養(yǎng)條件，將瘧原蟲(chóng)株系在37°C、5% CO2和90% N2氣氛下培養(yǎng)。

3. 多克隆性質(zhì)的確認(rèn)

- 提取每個(gè)瘧原蟲(chóng)株系的DNA，并在24個(gè)高度多態(tài)性SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

4. 單一寄生蟲(chóng)譜系的分離

- 通過(guò)限制稀釋法，將瘧原蟲(chóng)株系在96孔板中進(jìn)行稀釋?zhuān)苑蛛x單個(gè)受感染的紅細(xì)胞。

- 使用SYBR? Green I熒光染料檢測(cè)寄生蟲(chóng)DNA，確定陽(yáng)性孔。

5. 基因分型和系統(tǒng)發(fā)育分析

- 對(duì)每個(gè)陽(yáng)性孔中的寄生蟲(chóng)進(jìn)行基因分型，使用24-SNP分子條形碼法。

- 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析不同寄生蟲(chóng)譜系之間的關(guān)系。

6. 體外抗瘧藥敏感性測(cè)試

- 使用SYBR? Green Antimalarial Assay對(duì)氯喹、甲氟喹和哌拉喹的敏感性進(jìn)行測(cè)試。

- 測(cè)定每種藥物的半最大抑制濃度（IC50）。

7. 寄生蟲(chóng)存活試驗(yàn)

- 對(duì)于CQ和PPQ，使用環(huán)階段存活試驗(yàn)(RSA)和哌拉喹存活試驗(yàn)(PSA)來(lái)確定寄生蟲(chóng)對(duì)藥物的存活率。

8. 抗瘧藥抗性位點(diǎn)的測(cè)序和基因分型

8.1 目標(biāo)基因的選擇

選擇已知與抗瘧藥抗性相關(guān)的基因，包括但不限于：

- 氯喹抗性相關(guān)基因：pfcrt（瘧原蟲(chóng)氯喹抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）

- 甲氟喹和哌拉喹抗性相關(guān)基因：pfmdr-1（瘧原蟲(chóng)多藥耐藥1基因）

- 蒿甲醚抗性相關(guān)基因：K13基因

8.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

- 使用DNA提取試劑盒從瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)物中提取基因組DNA。

- 設(shè)計(jì)特異性引物，針對(duì)上述基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。例如，使用五組引物覆蓋整個(gè)pfcrt基因。

8.3 SNPs檢測(cè)

- 使用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)pfcrt、pfmdr-1和K13基因中的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。

- 利用測(cè)序結(jié)果分析軟件（如DNASTAR Lasergene）進(jìn)行序列數(shù)據(jù)的分析和可視化。

8.4 拷貝數(shù)變異檢測(cè)

- 使用ΔΔCT方法確定pfmdr-1和pfmp-2（瘧原蟲(chóng)血漿膜蛋白2基因）的拷貝數(shù)，這些基因與甲氟喹和哌拉喹抗性相關(guān)。

- 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）技術(shù)，在同一孔中同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)參基因（如β-微管蛋白基因或絲氨酸tRNA連接酶基因）。

8.5 qPCR實(shí)驗(yàn)操作

- 準(zhǔn)備主混合液，包含Multiplex Probe qPCR Mix Plus U （GDSBio, P2701）、無(wú)菌水、目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的預(yù)配方Taqman SNP檢測(cè)。

- 將主混合液分配到96孔PCR板中，每個(gè)樣本包含75 ng的寄生蟲(chóng)DNA。

- 使用CFX96實(shí)時(shí)PCR儀器進(jìn)行樣品擴(kuò)增，并使用基因表達(dá)模塊分析結(jié)果。

8.6 數(shù)據(jù)分析

- 將目標(biāo)基因的拷貝數(shù)與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)進(jìn)行比較，以確定相對(duì)拷貝數(shù)。

- 使用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品（如3D7株系）進(jìn)行校準(zhǔn)。

- 對(duì)于pfmdr-1和pfmp-2基因，分析是否存在基因擴(kuò)增現(xiàn)象，這可能與抗藥性發(fā)展有關(guān)。

8.7 結(jié)果記錄和解釋

- 記錄所有測(cè)序和qPCR結(jié)果，包括基因型和拷貝數(shù)。

- 解釋測(cè)序和拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)，分析它們與體外抗藥性表型之間的潛在聯(lián)系。

8.8 質(zhì)量控制

- 包括使用已知基因型的實(shí)驗(yàn)室控制株系作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

- 對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行重復(fù)，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

以上步驟提供了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程，用于檢測(cè)和分析與抗瘧藥抗性相關(guān)的基因變異。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)程和生物安全指南，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

9. 數(shù)據(jù)分析

- 使用GraphPad Prism軟件分析IC50值和存活率數(shù)據(jù)。

- 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)方法比較不同寄生蟲(chóng)譜系之間的差異。

10. 結(jié)果解釋和報(bào)告

- 解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，討論不同寄生蟲(chóng)譜系的抗藥性表型。

- 撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果和討論。

11. 安全性和質(zhì)量控制

- 確保實(shí)驗(yàn)操作符合生物安全標(biāo)準(zhǔn)。

- 使用已知的實(shí)驗(yàn)室控制株系作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

12. 實(shí)驗(yàn)材料的保存和記錄

- 記錄所有實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果。

- 保存所有原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)材料，以備后續(xù)分析和驗(yàn)證。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)方案提供了一個(gè)全面的框架，用于研究P. falciparum株系的多克隆性和抗藥性表型。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)程和生物安全指南。

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 

貨號(hào)：P2701，P2702，P2703，P2704 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介 

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 是用于探針?lè)▽?shí)時(shí)定量 PCR 的 2×濃縮預(yù)混液，使用時(shí) 只需加入模板、引物和探針即可進(jìn)行反應(yīng)。本品含有抗體技術(shù)修飾的熱啟動(dòng)酶 Hotstart Taq DNA 聚合酶，配合東盛特制的 Real Time PCR Buffer，不僅有效抑制引物二聚體和其他非 特異性擴(kuò)增，而且能夠提高擴(kuò)增效率，可以進(jìn)行多重探針 qPCR 反應(yīng)。該試劑引入 了 dUTP/UDG 防污染系統(tǒng)，可以在 PCR 反應(yīng)前清除含 dUTP 的 PCR 產(chǎn)物，有效避免因 擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染對(duì)定量的影響。本品方便用于制備 IVD 分子診斷試劑盒，對(duì)靶基因定 量準(zhǔn)確、可信度高，重復(fù)性好。本品可搭配 TaqMan 等各類(lèi)熒光探針使用，與常見(jiàn)定量 PCR 儀完美兼容，如 ABI、Roche、Bio-Rad 等。 

產(chǎn)品用途

探針?lè)ɑ虮磉_(dá)分析

多重低拷貝基因檢測(cè)

產(chǎn)品特點(diǎn)

可進(jìn)行多重探針?lè)晒舛縋CR

適合常見(jiàn)定量機(jī)型

高效熱啟動(dòng)技術(shù)帶來(lái)高特異和可重復(fù)的擴(kuò)增

含 dUTP/UDG 防污染系統(tǒng)

穩(wěn)定性高，適合大規(guī)模檢測(cè)